PCR起源
最早的关于核酸体外扩增的设想应该回溯到20世纪70年代初,发现DNA聚合酶的科学家Khorana和他的同事提出:“经过DNA变形,并与合适引物杂交,用DNA聚合酶延伸引物,并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。”1970年发现的DNA限制性内切酶,使体外克隆和扩增基因成为可能,于是便有了相应的手段。
PCR是什么
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤在体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
PCR反省的三个主要阶段(如下图):
1.变性:高温使双链DNA解离形成单链(95℃,30s)。
2.退火:低温下,引物与模板DNA互补区结合(45~65℃,30s)。
3.延伸:DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应(72℃,30 ~60s )。
述PCR的三个反应步骤循环往复,使得特定长度的靶DNA数量呈指数上升。在理论上,终产物DNA的量可用Yn=X•2n计算。其中X为原始模板的数量,Yn为n循环后DNA片段终产物的拷贝数,n为扩增循环数。但在实际扩增过程中,不可能达到理想状况下的100%扩增效率,因此,公式Yn=X•2n中2可以(1十E)来代替,而得到Yn=X•(1十E)n,E为平均扩增效率,理论值为100%,亦即为1,但在实际反应中平均效率达不到理论值。
PCR技术在医学检验领域得到了广泛的应用,人类许多常见的肿瘤疾病与某些肿瘤相关基因的遗传学改变有着密切的关系,可以通过PCR或将PCR与其他技术结合使用来检测基因序列的改变,对疾病进行辅助诊断或者早期评估。在进行产前诊断时,利用胎儿羊膜细胞、羊水甚至母亲血液便可以检查出胎儿的性别,这在与性染色体关联遗传病诊断中是很有必要的。PCR技术已在临床中应用多年,为肿瘤前期筛查,优生优育做出了巨大的贡献。
PCR检测技术在传染病检测领域尤其在病毒性传染病的快速确认中也发挥了不可替代的作用,如2009年甲型HIN1流感病毒、2013年H7N9禽流感病毒、2019年新型冠状病毒等近年来发生的重大病毒性传染病疫情,从病例的确认、排查到疾病的监测等工作中,PCR 检测技术均发挥了重要作用。
PCR技术在检验检疫领域中的应用,如在出入境检验检疫工作中,既可保证样品检测的准确性和可靠性,又可节省大量的人力、物力和财力。目前国内相关检验检疫部门已正式应用QPCR检验方法来检测禽流感病毒、新城疫病毒、口蹄疫病毒、猪蓝耳病毒等动物病毒,以及猪链球菌、炭疽、大肠杆菌0157等动物细菌,为有效控制传染性动物疫情在国际的传播起到显著的作用。
PCR技术作为一项“革命性的技术”,传统PCR技术以及衍生出来的新型PCR技术自面世以来,随着技术方法的不断改进与完善,已被广泛应用到生命科学的各个领域。PCR定量技术也在不断改进、完善,仪器设备和试剂费用也在大幅降低。PCR定量技术如何在不影响其特异性和灵敏度的情况下,提高PCR的重复性、易操作性和普适性将是其未来的发展方向。